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皮膚組織消化手冊

 更新時間:2016-02-16 點擊量:2473

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Worthington組織消化指南

引言

組織消化酶主要用于組織培養和細胞生物學研究的原代細胞的分離和收集。盡管這些消化酶已經普遍應用多年,但是對其組織消化和細胞收集的作用機制卻沒有全面的理解。  由此導致的結果便是選擇一種消化方法大多是隨機選擇或基于過去的經驗,而不是在*理解消化原理的基礎上選擇的消化方案,以及如何根據具體實驗目的修正消化方案以獲得更好的實驗結果。

細胞分離程序的目的是zui大程度的獲得功能活性的單個細胞,而影響結果的原因有很多,包括(不限于)以下:

1、組織類型

2、物種來源

3、動物年齡

4、遺傳改造情況(如knockouts

5、所用的消化培養液

6、所用的酶

7、消化酶中的雜質

8、所用消化酶的工作濃度

9、溫度

10孵育時間

通常前四個原因沒辦法選擇,而剩下的原因一般由經驗決定以獲取zui適實驗結果。

通過查閱文獻來選擇*組織消化酶和zui適消化條件的研究人員通常被互相矛盾的實驗數據搞得一頭霧水。這些巨大差異來源于組織胞外基質的復雜而動態的特性,以及過去常用的粗制、未提純的組織分離酶。另外,組織胞外基質由各種蛋白、糖蛋白、脂類和糖脂組成,這些成分的組成比例在不同物種、不同組織、甚至不同發育(年齡)之間存在明顯的差異,這些因素都極大的影響了消化方案的制定。目前通常使用的粗制酶,如鏈霉蛋白酶、NF1:250、以及含有幾種其他不同濃度蛋白酶的膠原酶、以及各種多糖酶、核酶和脂酶。

本指南總結了目前常用組織消化酶的zui適消化和細胞收集知識和方法,描述了標準的實驗步驟, 便于制定一個*的細胞分離方案,同時列舉了一些相關的參考文獻。

下表列出多種組織的適宜消化酶(含參考文獻,以組織類型和物種分類,詳見鏈接)

脂肪組織

腎上腺組織

骨組織

腦組織

軟骨組織

結腸組織

內皮組織

上皮組織

心臟

淋巴結

乳腺

其它組織

其他組織

肌組織

神經組織

胰腺

腮腺

垂體

前列腺

生殖

動物鱗片

皮膚

脾臟

干細胞

胸腺

甲狀腺/甲狀旁腺

扁桃體

腫瘤

 

 

 

注:使用Worthington公司消化酶的文獻不限于上表鏈接中所列,一般而言,Worthington公司的組織消化酶可用于大多組織類型的消化。

 

皮膚組織消化手冊

 

物種詳細來源細胞名稱消化用酶培養基參考文獻
EpidermalCollagenase: 0.35%DMEMZheng, Y., Nace, A., Chen, W., Watkins, K., Sergott, L., Homan, Y., Vandeberg, J., Breen, M. and Stenn, K.: Mature Hair Follicles Generated from Dissociated Cells: A Universal Mechanism of Folliculoneogenesis., Dev Dyn 239, 2619-26, 2010
Neutral Protease: 0.1%
青蛙青蛙EpidermalTrypsin: 0.18%Barth's solution, CMFNishikawa, A., Shimizu-Nishikawa, K., and Miler, L.: Isolation, characterization, and in vitro culture of larval and adult epidermal cells of the frog Xenopus laevis, In Vitro Cell Dev Biol 26, 1128, 1990
山羊山羊Dermis isolated aggrecan sensitiveNeutral Protease: 0.5%DMEMDeng, Y., Hu, J. and Athanasiou, K.: Isolation and Chondroinduction of a Dermis-Isolated, Aggrecan-Sensitive Subpopulation with High Chondrogenic Potential., Arthritis Rheum 56, 168, 2007
Collagenase Type 2: 200 u/ml
人類人類SkinNeutral Protease: 5 u/mlRPMI 1640Cheuk, S., Wiken, M., Blomqvist, L., Nylen, S., Talme, T., Stahle, M.and Eidsmo, L.:Epidermal Th22 and Tc17 Cells Form a Localized Disease Memory in Clinically Healed Psoriasis.,J Immunol 192, 3111, 2014
Collagenase Type 3: 0.3%
Deoxyribonuclease I: 0.005%
人類人類Skin FibroblastsCollagenase Type 1: 1000 u/mlDMEMDouvaras, P., Wang, J., Zimmer, M., Hanchuk, S., O'Bara, M., Sadiq, S., Sim, F., Goldman, J. and Fossati, V.: Efficient Generation of Myelinating Oligodendrocytes from Primary Progressive Multiple Sclerosis Patients by Induced Pluripotent Stem Cells., Stem Cell Reports3, 250, 2014
人類人類, 成年的Epidermal stem cellsNeutral Protease: 2 u/mlDMEMNagel, S., Rohr, F., Weber, C., Kier, J., Siemers, F., Kruse, C., Danner, S., Brandenburger, M. and Matthiessen, A.: Multipotent Nestin-Positive Stem Cells Reside in the Stroma of Human Eccrine and Apocrine Sweat Glands and can be Propagated Robustly In Vitro., PLoS ONE 8, e78365, 2013
Trypsin: 2.5%
人類人類FibroblastsCollagenase animal free: 2%HBSSKarumbayaram, S., Lee, P., Azghadi, S., Cooper, A., Patterson, M., Kohn, D., Pyle, A., Clark, A., Byrne, J., Zack, J., Plath, K. and Lowry, W.: From Skin Biopsy to Neurons Through a Pluripotent Intermediate Under Good Manufacturing Practice Protocols, Stem Cells Transl Med 1, 36, 2012
人類人類, 女性, 18-66 歲FibroblastsTrypsin: 0.2%DMEMHuschtscha, L., Napier, C., Noble, J., Bower, K., Au, A., Campbell, H., Braithwaite, A. and Reddel, R.: Enhanced Isolation of Fibroblasts From Human Skin Explants., Biotechniques 53, 239, 2012
人類人類EpidermalCollagenase: 0.35%DMEMZheng, Y., Nace, A., Chen, W., Watkins, K., Sergott, L., Homan, Y., Vandeberg, J., Breen, M. and Stenn, K.: Mature Hair Follicles Generated from Dissociated Cells: A Universal Mechanism of Folliculoneogenesis., Dev Dyn 239, 2619-26, 2010
Neutral Protease: 0.1%
人類人類skin and keloid progenitor cellsCollagenase Type 1: 0.4%PBSZhang, Q., Yamaza, T., Kelly, AP, Shi, S., Wang, S., Brown, J., Wang, L., French, S., Shi, S. and Le, A.: Tumor-like Stem Cells Derived from Human Keloid are Governed by the Inflammatory Niche Driven by IL-17/IL-6 Axis., PLoS ONE 4, e7798, 2009
Neutral Protease: 0.3%
人類人類FibroblastsCollagenase Type 1: 100-320 u/mlDMEMTuan, T., Hwu, P., Ho, W., Yiu, P., Chang, R., Wysocki, A. and Benya, P.: Adenoviral Overexpression and Small Interfering RNA Suppression Demonstrate that Plasminogen Activator Inhibitor-1 Produces Elevated Collagen Accumulation in Normal and Keloid Fibroblasts., Am J Pathol 173, 1311-25, 2008
人類人類, 6-12 歲Dermal fibroblastsNeutral Protease: 0.1%DMEMChen, F., Zhang, W., Bi, D., Liu, W., Wei, X., Chen, F., Zhu, L., Cui, L. and Cao, Y.: Clonal Analysis of Nestin(-) Vimentin(+) Multipotent Fibroblasts Isolated from Human Dermis., J Cell Sci120, 2875, 2007
Collagenase Type 1: 0.1%
人類人類Hair follicular epithelialNeutral Protease: 1.25%DMEM/F-12Yu Hong, Fang Dong, Kumar Suresh M, Li Ling, Nguyen Thiennga K, Acs Geza, Herlyn Meenhard, Xu Xiaowei: Isolation of a novel population of multipotent adult stem cells from human hair follicles, Am J Pathol 168, 1879-88, 2006
Trypsin: 0.25%
人類人類fibroblastsCollagenase: 0.5%DMEM/F12Clark, R., Chong, B., Mirchandani, N., Yamanaka, K., Murphy, G., Dowgiert, R. and Kupper, T.: A Novel Method for the Isolation of Skin Resident T cells from Normal and Diseased Human Skin., J Invest Dermatol 126, 1059, 2006
Trypsin: 0.25%
人類人類, 新生的KeratinocytesNeutral Protease: 0.4%DMEMLi, A., Pouliot, N., Redvers, R., and Kaur, P.: Extensive tissue-regenerative capacity of neonatal human keratinocytes stem cells and their progeny, J Clin Invest 113, 390-400, 2004
Collagenase: 0.3%
人類人類Mast cellsNeutral Protease: 0.05%RPMIBabina Magda, Guhl Sven, Starke Andrae, Kirchhof Loreen, Zuberbier Torsten, Henz Beate M: Comparative cytokine profile of human skin mast cells from two compartments--strong resemblance with monocytes at baseline but induction of IL-5 by IL-4 priming, J Leukoc Biol 75, 244-52, 2004
Collagenase Type 4: 1.0%
人類人類, 成年的Dermal fibroblastsCollagenase: 0.5-1.0%DMEMWang, H., Van Blitterswijk, C., Bertrand-De Haas, M., Schuurman, A. and Lamme, E.:Improved Enzymatic Isolation of Fibroblasts for the Creation of Autologous Skin Substitutes., In Vitro Cell Dev Biol Anim 40, 268, 2004
人類人類FibroblastsTrypsin: 0.25%DMEMTuan Tai-Lan, Wu Huayang, Huang Eunice Y, Chong Sheree S N, Laug Walter, Messadi Diana, Kelly Paul, Le Anh: Increased plasminogen activator inhibitor-1 in keloid fibroblasts may account for their elevated collagen accumulation in fibrin gel cultures, Am J Pathol 162, 1579-89, 2003
人類人類Keratinocytes, fibroblasts, endothelialNeutral Protease: see referencesee referenceSupp Dorothy M, Wilson-Landy Kaila, Boyce Steven T: Human dermal microvascular endothelial cells form vascular analogs in cultured skin substitutes after grafting to athymic mice, FASEB J 16, 797-804, 2002
Collagenase: see reference
人類人類, 成年的KeratinocytesNeutral Protease: 0.25%PBSBaudoux, B., Castanares-Zapatero, D., Leclercq-Smekens, M., Berna, N., and Poumay, Y.: The Tetraspanin CD9 Associates with the Integrin a6B4 in Cultured Human Epidermal Keratinocytes and is Involved in Cell Motility, Eur J Cell Biol 79, 41, 2000
人類人類KeratinocytesNeutral Protease: 0.25%see referenceHybbinette S, Bostrom M, Lindberg K: Enzymatic dissociation of keratinocytes from human skin biopsies for in vitro cell propagation, Exp Dermatol 8, 30-8, 1999
Trypsin: 0.17%
Thermolysin: 0.05%
人類人類Human skin mast cellsNeutral Protease: 0.1%PBSGrutzkau A, Kruger-Krasagakes S, Baumeister H, Schwarz C, Kogel H, Welker P, Lippert U, Henz BM, Moller A: Synthesis, storage, and release of vascular endothelial growth factor/vascular permeability factor (VEGF/VPF) by human mast cells: implications for the biological significance of VEGF206, Mol Biol Cell 9, 875-84, 1998
Collagenase Type 1: see reference
人類人類EpidermalCollagenase Type 2: 0.1%PBSReece J C, Handley A J, Anstee E J, Morrison W A, Crowe S M, Cameron P U: HIV-1 selection by epidermal dendritic cells during transmission across human skin, J Exp Med 187, 1623-31, 1998
Neutral Protease: 0.5-1.0%
人類人類KeratinocytesTrypsin: 0.05%Dulbecco's PBSJudd, D., Battista, P., and Behm, D.: Culture of Human Keratinocytes in Defined Serum-Free Medium, Focus 19 (1), 2, 1997
人類人類Epidermis plus dermisTrypsin: 0.125%DMEM, M199Harley, C., and Sherwood, S.: Methods in Molecular Biology, Basic Cell Culture Protocols, 2nd ed. Vol. 75,Pollard, J., and Walker, J., Humana Press, 23, 1997
Abdomen or inner forearm
人類人類KeratinocytesTrypsin: 0.25%DMEMRegnier, M: Culture of Human Karatinocytes,Cell & Tissue Culture: Laboratory Procedures Vol. 1,Doyle, A., Griffiths, J., and Newell, D., John Wiley and Sons Ltd, 11B:4.1, 1995
人類人類, 成年的, 女性, 乳房皮膚KeratinocytesTrypsin: 0.25%PBSHirel, B., Chesne, C., Pailgheret, J., and Guillouzo, A.: Expression of Differentiation Markers in Human Adult Keratinocytes Cultured in Submerged Conditions, In Vitro Cell Dev Biol 30A, 372, 1994
人類人類, 新生兒包皮FibroblastsTrypsin: 0.25%DMEMHansbrough, J., Cooper, M., Cohen, R., Spielvogel, R., Greenleaf, G., Bar, R., and Naughton, G.: Evaluation of a Biodegradable Matrix Containing Cultured Human Fibroblasts as a Dermal Replacement Beneath Meshed Skin Grafts on Athymic Mice, Surgery 111 (1), 438, 1992
人類人類, 18-50 歲Sweat ductCollagenase: 0.03%MEMBell, C. and Quinton, P.: Effects of Media Buffer Systems on Growth and Electrophysiologic Characteristics of Cultured Sweat Duct Cells, In Vitro Cell Dev Biol 27, 47, 1991
人類人類FibroblastsTrypsin: 0.25%CMF solutionLimat, A., Hunziker, T., Boillat, C., Noser, F., and Wiesmann, U.: Postmitotic Human Dermal Fibroblasts Preserve Intact Feeder Properties for Epithelial Cell Growth After Long-Term Cryopreservation, In Vitro Cell Dev Biol 26, 709, 1990
人類人類Sweat glandCollagenase Type 2: 0.015%(see reference)Krouse, M., Hagiqara, G., Chen, J., Lewiston, N., and Wine, J.: Ion Channels in Normal Human and Cystic Fibrosis Sweat Gland Cells, Am J Physiol 257, C129, 1989
人類人類, 年齡16-30Human sweat ductCollagenase Type 2: 0.2%RPMI 1640Pedersen, P.: Human Sweat Duct Cells in Primary Culture. Basic Bioelectric Properties of Cultures Derived From Normals and Patients with Cystic Fibrosis, In Vitro Cell Dev Biol 25 (4), 342, 1989
(see reference)
人類人類Melanocytes, skin/ foreskinTrypsin: 0.25%PBSPeacocke, M., Yaar, M., Mansur, C., Chao, M., and Gilchrest, B.: Induction of Nerve Growth Factor Receptors on Cultured Human Melanocytes, Proc Natl Acad Sci U S A 85, 5282, 1988
人類人類Human sweat glandsCollagenase: 0.2%HBSSLee, C., Carpenter, F., Coaker, T., and Kealey, T.: The Primary Culture of Epithelia From the Secretory Coil and Collecting Duct of Normal Human and Cystic Fibrotic Eccrine Sweat Glands, J Cell Sci 83, 103, 1986
人類人類KeratinocytesTrypsin: 0.25%DMEMDover, R. and Potten, C.: Cell Cycle Kinetics of Cultured Human Epidermal Keratinocytes, J Invest Dermatol 80, 423, 1983
人類人類, 成年的Epidermal keratinocytesTrypsin: 0.25%Eagle's MEMAlitalo K, Kuismanen E, Myllyla R, Kiistala U, Asko-Seljavaara S, Vaheri A: Extracellular matrix proteins of human epidermal keratinocytes and feeder 3T3 cells, J Cell Biol 94, 497-505, 1982
Collagenase: 0.2%
Deoxyribonuclease I: 0.001%
人類人類, fetalSmooth muscle, fibroblastsTrypsin: 0.055%DMEMDavies, P. and Kerr, C.: Modification of LDL Metabolism by Growth Factors in Cultured Vascular Cells and Human Skin Fibroblasts, Biochim Biophys Acta 712, 26, 1982
人類人類, 18-30歲, 男性, 女性FibroblastsTrypsin: 0.1%HBSSMcCoy, B., Galdun, J., and Cohen, I.: Effects of Density and Cellular Aging On Collagen Synthesis and Growth Kinetics in Keloid and Normal Skin Fibroblasts, In Vitro 18 (1), 79, 1982
人類人類, 新生兒KeratinocytesTrypsin: 0.3%DMEMLiu, S., Eaton, M., and Karasek, M.: Growth Characteristics of Human Epidermal Keratinocytes from Newborn Foreskin in Primary and Serial Cultures, In Vitro 15 (10), 813, 1979
人類人類KeratinocytesTrypsin: 0.25%(see reference)Rheinwald, J., and Green, H.: Serial C*tion of Strains of Human Epidermal Kerotinocytes: The Formation of Keratinizing Colonies from Single Cells, Cell 6, 331, 1975
小鼠小鼠EpidermalNeutral Protease: 0.5%DMEMGu, D., Fan, Q and Xie, J.: Cell Population Analyses During Skin Carcinogenesis., J Vis Exp , e50311, 2013
Collagenase Type 4: 0.1%
小鼠小鼠Epithelial StemTrypsin: 0.25%HBSSJensen, U., Ghazizadeh, S. and Owens, D.: Isolation and Characterization of Cutaneous Epithelial Stem Cells., Methods Mol Biol 989, 61-9, 2013
Collagenase Type 1: 0.4%
小鼠小鼠Dermal fibroblastsCollagenase: 400 u/mlAminoMAX IIScheibye-Knudsen, M., Ramamoorthy, M., Sykora, P., Maynard, S., Lin, P., Minor, R., Wilson, D., Cooper, M., Spencer, R., de Cabo, R., Croteau, D. and Bohr, V.: Cockayne Syndrome Group B Protein Prevents the Accumulation of Damaged Mitochondria by Promoting Mitochondrial Autophagy., J Exp Med 209, 855, 2012
小鼠小鼠Epidermal and dermalCollagenase Type 4: 0.18%PBSKing, I., Kroenke, M. and Segal, B.: GM-CSF-Dependent, CD103+ Dermal Dendritic Cells Play a Critical Role in Th Effector Cell Differentiation After Subcutaneous Immunization., J Exp Med 207, 953, 2010
Collagenase/Dispase: 0.18%
小鼠小鼠, 2-3 天Dermal fibroblastsCollagenase Type 2: 0.04%DMEFarina, G., York, M., Di Marzio, M., Collins, C., Meller, S., Homey, B., Rifkin, I., Marshak-Rothstein, A., Radstake, T. and Lafyatis, R.: Poly(I:C) Drives Type I IFN- and TGF尾-Mediated Inflammation and Dermal Fibrosis Simulating Altered Gene Expression in Systemic Sclerosis., J Invest Dermatol 130, 2583-93, 2010
Trypsin: 0.025%
小鼠小鼠DermalCollagenase Type 3: 0.3%HBSSEidsmo, L., Allan, R., Caminschi, I., Van Rooijen, N., Heath, W. and Carbone, F.:Differential Migration of Epidermal and Dermal Dendritic Cells During Skin Infection., J Immunol 182, 3165, 2009
Deoxyribonuclease I: 0.0005%
小鼠小鼠, 新生的DermalCollagenase: 0.35%PBSCrigler Lauren, Kazhanie Amita, Yoon Tae-Jin, Zakhari Julia, Anders Joanna, Taylor Barbara, Virador VictoriaM: Isolation of a mesenchymal cell population from murine dermis that contains progenitors of multiple cell lineages, FASEB J 21, 2050-63, 2007
Deoxyribonuclease I: see reference
小鼠小鼠Dermal fibroblastsTrypsin: 0.25%DMEMBaxter Ruth M, Crowell Thomas P, McCrann Margaret E, Frew Erica M, Gardner Humphrey: Analysis of the tight skin (Tsk1/+) mouse as a model for testing antifibrotic agents,Lab Invest 85, 1199-209, 2005
Collagenase Type 1: 0.25%
小鼠小鼠, 新生的Microvascular endothelialNeutral Protease: 0.005%DMEMCha, S., Talavera, D., Demir, E., Nath, A. and Sierra-Honigmann, M.: A Method of Isolation and Culture of Microvascular Endothelial Cells from Mouse Skin., Microvasc Res 70, 198, 2005
Collagenase Type 1: 4%
小鼠小鼠, male 6-24 weekSkin side populationCollagenase Type 4: 0.2%PBSMontanaro F, Liadaki K, Volinski J, Flint A, and Kunkel LM.: Skeletal muscle engraftment potential of adult mouse skin side population cells, Proc Natl Acad Sci U S A 100, 9336, 2003
Neutral Protease: 1.2 u/ml
小鼠小鼠Ear epidermalTrypsin: 0.1%PBSTakanami-Ohnishi Yoko, Amano Shinya, Kimura Sadao, Asada Sachie, Utani Atsushi, Maruyama Masumi, Osada Hiroyuki, Tsunoda Hajime, Irukayama-Tomobe Yoko, Goto Katsutoshi, Karin Michael, Sudo Tatsuhiko, Kasuya Yoshitoshi: Essential role of p38 mitogen-activated protein kinase in contact hypersensitivity, J Biol Chem 277, 37896-903, 2002
Collagenase: 0.2%
小鼠小鼠, 3-7 月Fibroblasts, mesangial, smooth muscleTrypsin: 0.25%DMEMBradshaw AD, Francki A, Motamed K, Howe C, Sage EH: Primary mesenchymal cells isolated from SPARC-null mice exhibit altered morphology and rates of proliferation, Mol Biol Cell 10, 1569-79, 1999
Collagenase: see reference
Soybean Trypsin Inhibitor: .05%
豬, 3-4 月Synovial membrane and skin stem cellsCollagenase: 0.2%DMEMAndo, W., Kutcher, J., Krawetz, R., Sen, A., Nakamura, N., Frank, C. and Hart, D.: Clonal Analysis of Synovial Fluid Stem Cells to Characterize and Identify Stable Mesenchymal Stromal Cell/Mesenchymal Progenitor Cell Phenotypes in a Porcine Model: A Cell Source with Enhanced Commitment to the Chondrogenic Lineage., Cytotherapy 16, 776, 2014
豬, 2-6 月KeratinocytesNeutral Protease: 0.25%Dulbecco-Vogt MEMRegauer S, Compton C: Cultured porcine epithelial grafts: an improved method, J Invest Dermatol 94, 230-4, 1990
大鼠Wistar大鼠, 4-8 天Dermal fibroblasts and keratinocytesTrypsin: 0.25%Ham's F-12Sugihara, H and Toda, S: Primary Tissue Intact and Dissociated Cell Culture,Cell & Tissue Culture: Laboratory Procedures Vol. 1,Doyle, A., Griffiths, J., and Newell, D., John Wiley and Sons, Ltd., 3A:2.1, 1995
大鼠SD大鼠,  雄性, 40-60 天SebaceousTrypsin: 0.2%DMEM with FBSLaurent, S., Mednieks, M., and Rosenfield, R.: Growth of Sebaceous Cells in Monolayer Culture, In Vitro Cell Dev Biol 28, 83, 1992
PBS
大鼠大鼠, 新生的, 產后的12-24 小時 FibroblastsTrypsin: 0.2%HEPES buffered DMEMAcheson, A., Barker, P., Alderson, R., Miller, F., and Murphy, R.: Detection of Brain-Derived Neurotrophic Factor-like Activity in Fibroblasts and Schwann Cells: Inhibition by Antibodies to NGF, Neuron 7, 265, 1991
大鼠大鼠, 白化變種, 一天大, CFNKeratinocytesTrypsin: 1%EBSSVaughan, F., Gray, R., and Bernstein, I.: Growth and Differentiation of Primary Rat Keratinocytes on Synthetic Membranes, In Vitro Cell Dev Biol 22 (3), 141, 1986

 

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