線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1))說明書

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產品詳情

產品描述

線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)是利用 JC-1 作為膜電位識別的熒光探針，能夠快速靈敏地檢測細胞、組織或純化的線粒體膜電位變化，用于早期的細胞凋亡檢測。

JC-1 是一種廣泛用于檢測線粒體膜電位△Ψm 的理想熒光探針。可以檢測細胞、組織或純化的線粒體膜電位。其檢測原理為：當 JC-1 進入細胞后，正常細胞中線粒體膜電位較高，在此條件下 JC-1 會聚集在線粒體的基質中，形成聚合物，進而產生紅色熒光；當線粒體膜電位較低時，JC-1 不能聚集在線粒體的基質中， 此時 JC-1 以單體存在，產生綠色熒光。實際使用過程中，我們通常通過比較紅綠熒光的相對比例來衡量線粒體去極化的程度，方便地通過熒光顏色的轉變來檢測線粒體膜電位的變化。線粒體膜電位的下降是細胞凋亡早期的標志性事件。通過 JC-1 從紅色熒光到綠色熒光的轉變，可以很快速地捕捉到細胞膜電位的下降；同時紅色到綠色熒光的轉變，也可以作為細胞凋亡早期的一個檢測指標。JC-1 單體的最大激發(fā)波長為 515nm，最大發(fā)射波長為 529nm；JC-1 聚合物的最大激發(fā)波長為585nm，最大發(fā)射波長為 590nm。觀察時，使用常規(guī)的觀察紅色熒光和綠色熒光的設置即可。本試劑盒提供 CCCP 作為誘導線粒體膜電位下降的陽性對照。

產品組成

包裝清單：

使用本試劑盒檢測 A549 細胞在正常和造模前后的線粒體膜電位的效果圖。正常 A549 細胞經 JC-1 染色后以聚合物形式存在，呈明亮的紅色熒光，綠色熒光很弱；使用 CCCP（10μM）誘導使線粒體膜電位下降后，JC-1 以單體存在形式居多，因此線粒體內紅色熒光強度顯著降低，而綠色熒光顯著增強。

運輸與保存

-20℃避光保存，避免反復凍融。JC-1緩沖稀釋液4℃保存，至少2周內有效。

實驗步驟

1. JC-1 染色工作液的配制：

取適量 JC-1 (200X)，按照每 5µl +995 μl JC-1 緩沖稀釋液（1X）的比例稀釋至 1X JC-1 染色工作液。 注：試劑盒標配 JC-1 緩沖稀釋液為 10X，使用前用三蒸水稀釋至 1X 使用，配置前應于 37℃水浴至室溫后方可使用，以免稀釋液過冷染色過程對細胞有刺激影響實驗結果，稀釋時將JC-1 緩沖稀釋液（1X）快速加入到 200X 的 JC-1 母液中稀釋效果更佳。一般建議 6 孔板每孔使用 JC-1 染色工作液量為 1ml，其它培養(yǎng)器皿用量以此類推。對于細胞懸液每 5-10*106 細胞加 0.5ml JC-1 染色工作液（1X）。

2. 陽性對照組：

該試劑盒包含陽性對照 CCCP（10 mM），CCCP 可以誘導細胞線粒體膜電位變化。使用方法：用細胞培養(yǎng)液配制 CCCP，推薦終濃度為 10 µM，對于不同細胞 CCCP 濃度可自行調整。正常條件下，10 µM CCCP處理 20 分鐘后線粒體的膜電位會明顯改變，此時，JC-1 染色后可觀察到明顯的綠色熒光；相反，正常的細胞經 JC-1 染色后顯示紅色熒光。

3. 懸浮細胞處置：

a) 取5-10*106細胞，用0.5ml 細胞培養(yǎng)液重懸細胞。

b) 加入0.5ml JC-1染色工作液，顛倒數(shù)次混勻。置于細胞培養(yǎng)箱中37℃孵育20-30分鐘；不同細胞根據(jù)實驗可自行調整染色時間。

b) 孵育結束后，700g 4℃離心，收取沉淀細胞。

c) 用JC-1 緩沖稀釋液（1X）洗滌 2-3 次：加入 1 ml JC-1 染色工作液重懸細胞，隨后用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察，也可用流式細胞儀分析。

4. 貼壁細胞處置：

a) 6 孔板貼壁細胞處理過程如下：首先，棄培養(yǎng)液，用常溫 PBS 或培養(yǎng)液輕洗細胞2次，加入1ml新鮮細胞培養(yǎng)液。陽性對照組中加入CCCP（終濃度 10 µM）提前置于孵箱中處理20-30分鐘；

b) 隨后，加入1ml JC-1 染色工作液，充分混勻。置于培養(yǎng)箱中 37℃孵育30-60分鐘不等（可根據(jù)實驗情況調整）。

d) 孵育結束后，棄上清，用 JC-1 緩沖稀釋液（1X）洗滌細胞 2 次。

e) 加入 1 ml 細胞培養(yǎng)液，于熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡下觀察。

5. 純化的線粒體：

a) 1 ml 染色體系包含：0.9 ml JC-1 染色工作液+0.1ml純化的線粒體 (10-100µg)；置于37℃孵育 20-30 分鐘，期間可上下顛倒孵育液，使染色更加均一且充分。

b) 孵育結束后，可用熒光分光光度計或熒光酶標儀檢測：熒光分光光度計檢測：激發(fā)波長為485nm，發(fā)射波長為 590 nm。熒光酶標儀檢測時，激發(fā)波長可在 475-520 nm 范圍內設置。具體可參考步驟6中的條件進行熒光檢測。

c) 用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察：方法同步驟6。

6. 熒光檢測與數(shù)據(jù)分析：

JC-1 單體的激發(fā)波為 490 nm，發(fā)射光波長為 530 nm；JC-1 聚合物，激發(fā)波長為 525 nm，發(fā)射波長為

590 nm。實際測試過程中，可依據(jù)實驗室儀器的相關參數(shù)進行設置，不必把激發(fā)和發(fā)射波長設置在最大激發(fā)波長和最大發(fā)射波長。熒光顯微鏡或共聚焦觀察時，JC-1 單體的檢測可參照其它綠色熒光時的設置，如GFP 或 FITC 通道；同理，JC-1 聚合物的檢測時可以參考其它紅色熒光，如碘化丙啶或 Cy3 的設置。因此， 出現(xiàn)綠色熒光說明線粒體膜電位下降，我們可以通過比較紅綠熒光的相對比例衡量線粒體膜電位的變化。

注意事項

8. 注意事項：

a) JC-1 探針母液（A 試液）：DMSO 溶解，-20℃避光保存；盡量減少反復凍融。

b) JC-1  緩沖稀釋液（B 試液）：如需無菌操作，使用前可用 0.2μm 濾膜過濾后裝瓶使用即可。4℃保存，至少2周內有效。

  c) CCCP（C 試液）：DMSO 溶解，-20℃避光保存；盡量減少反復凍融。洗滌時也可以用 Hanks' Balanced Salt Solution、PBS 等替代JC-1 緩沖稀釋液。